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冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實驗要點及說明：

1．本方法適用于貼壁細胞培養，而不適用于懸浮細胞培養，懸浮細胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應該為優質玻璃，并經過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕；

4．如果需要更多生長狀態一致的細胞，可以使用較大的培養皿，但不宜過大，以避免培養液的浪費和增加污染機率；

5．如果細胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

實驗報告：

一、分離與培養：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；

5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

 TTK 基因全長ORF克隆

 FGF6 基因全長ORF克隆

 PDE4B 轉錄變體b 基因全長ORF克隆

 PRKAG1 基因全長ORF克隆

 METTL1 基因全長ORF克隆

 CD28 基因全長ORF克隆

 CSGALNACT2 基因全長ORF克隆

 HDAC2 基因全長ORF克隆

 CETN1 基因全長ORF克隆

 ENPP5 基因全長ORF克隆

NCI-H1568 [H1568]（非小細胞肺癌細胞) 31.2-2000 pg/mL 人天門冬氨酰/天冬酰胺酰β羥化(Aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase)ELISA試劑盒

78-5000 pg/mL ELISA Kit for Human Peroxiredoxin-4

0.312-20 ng/mL 炭疽桿菌(BA)核酸檢測試劑盒

0.312-20 ng/mL ELISA Kit for Human Heat shock protein beta-1

0.156-10 ng/mL 人淋巴細胞6/尿激型纖溶原激活因子受體結構域蛋白3(LYPD3)ELISA試劑盒

營養瓊脂（NA） 英文名稱：Nutrient Agar 產品規格：250g

0.312-20 ng/mL 人清道夫受體B（SRB1）ELISA試劑盒

0.312-20 ng/mL 人血管生成素1(ANG-1)ELISA試劑盒

3%氯化鈉MR-VP培養基 英文名稱：3% NaCl MR-VP Medium 產品規格：20支

0.156-10 ng/mL 人腸血管活性肽受體1 ELISA試劑盒